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體內/體外實驗設計中抑制劑的添加

ED50,Ki50,IC50,Kd50和pIC50各指什么?它們有什么區別
藥理和生化研究中,以下一些術語常常被用來描述藥物或抑制劑的功效;有時如果研究者沒有弄清 原文獻作者使用的術語的確切含義,在重復這些實驗時會產生困擾。 EC50值:藥物達到最大臨床功效(有時是抑制或刺激效果)50%時的濃度。這是一個藥用術語。 ED50值:50%的個體表現特定藥效時藥物的有效劑量(而非濃度)。
IC50值: 達到50%抑制效果時抑制劑的濃度。
Ki50值: 檢測到50%抑制效果時的抑制劑的濃度(采用Michaelis-Menten動力學計算而獲得)。
Kd50值:二個或更多生物分子組成的復合物分離成組分時的平衡常數;例如,抑制劑或底物從酶分離時的pIC50值。
pIC50值:IC50值的10的負對數。

2. 體外實驗中需要加多少抑制劑?
通常建議客戶參考同模型實驗發表的文獻報道;
除參考文獻報道以外,還需要通過預實驗做“劑量-效應曲線”確定最佳作用濃度(濃度梯度);通過“時間-效應曲線”確定最佳孵育時間(處理時間梯度)。
另外,抑制劑的使用量受多種因素影響,包括抑制對象的可接觸性,細胞通透性,孵育時間,細胞種類等等。我們建議通過檢索文獻確定使用抑制劑的起始濃度。如果有報道的Ki值或IC50值,可以采用其5-10 倍的量開始嘗試以達到抑制酶活性的最佳效果。如果抑制劑的Ki值或IC50值未知,則需要在更廣泛的范圍嘗試抑制劑的使用濃度,并采用Michaelis-Menten動力學計算Ki值。一般設立溶解抑制劑時所采用的溶劑作為對照,以排除溶劑的非特異性影響。

3. 體內實驗時需要注射多少抑制劑或者刺激藥物呢?
需要通過一些經驗性的預實驗來獲得試劑的優化劑量。首要考慮是這種試劑必須具備細胞穿透性。檢索報道過的IC50值,ED50值或EC50值也非常必要。以下介紹一個抑制劑用量的常用估算方法:
注射量(μg)=IC50(nM)×5~10×分子量×體重(g)×體液占體重的百分數(%)×10-6
以H-89(一種二氫氯化物)為例。這是一種細胞穿透性蛋白激酶A抑制劑,IC50值為48nM,分子量是 519.3,240-480nM可以產生足夠的蛋白激酶A的抑制效果?;铙w(in vivo)實驗時我們還需要做一些估算。假定一只200g的大鼠含水量為70%,則抑制劑約在140ml中分布;這樣240nM =240nmoles/L= 124.63μg/L。抑制劑溶于140ml,即124.63×0.140 = 17.45μg,所以這只200g的大鼠需要注射的劑量為17.45μg。
同時,抑制劑在體內的實際分布與注射方式(靜脈注射,肌肉注射還是腹腔注射?) 藥物利用率,半衰期,肝腎清除率,與蛋白的結合,組織特異性分布與富集等等緊密相關。特定組織或器官吸收抑制劑的量也往往比分離的細胞吸收量少。在整個活的動物體上的研究,常常要求抑制劑達到一定的目標濃度的負荷劑量,因此也需要通過持續給藥以保持血液中相應的抑制劑濃度。做這類實驗必須特別小心,以免在動物上用藥過量。

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